MitoTracker Deep Red FM

配制 MitoTracker Deep Red FM 儲存液:

※ 是以粉末形式提供，使用前需產品回溫至室溫。

※ 之后使用細胞培養級別的無水DMSO 將其充分溶解至終濃度1 mM。

※ 分子量：M. Wt.= 543.58 g/mol，換算下來，50 µg粉末只需加入92 µL DMSO即可得到1 mM儲存液。

※ 可根據單次的使用量將儲存液分裝后放到-20℃避光，避免反復凍融。

2. 配置工作液

※ 根據不同的實驗目的使用不同的探針濃度，以下的起始操作條件僅作參考，可根據細胞類型和其他的相關因素如細胞或組織的透化等進行適當調整。

※ 用適當的緩沖液或者細胞培養基稀釋1 mM儲存液至工作液濃度。一般推薦使用濃度為25-500 nM。對于后續需要做固定或透化的樣本，推薦工作濃度為100-500 nM，為了降低過度加載導致的潛在偽影和線粒體毒性，在不影響實驗結。
※ 果的前提下應盡可能低濃度染色。另外，濃度過高也可能對其他細胞結構進行染色。

3. 染色及檢測

1）貼壁細胞的染色

培養皿/板內加入適量的培養基覆蓋蓋玻片進行爬片培養。當細胞長至所需豐度，吸除培養液，加入37℃預熱的MitoTracker® Deep Red FM染色工作液。在所使用細胞正常培養條件下孵育15-45 min（最佳孵育時間需優化）。染色結束后，使用新鮮培養液或緩沖液替換上述染色液，即可將其置于熒光顯微鏡下觀察或熒光酶標儀下讀數?；蛘哌M行后續的固定和透化步驟，見步驟4。

2）懸浮細胞的染色

離心收集細胞，吸除上清，利用37℃預熱的MitoTracker® Deep Red FM染色工作液輕輕重懸細胞。在所使用細胞正常培養條件下孵育15-45 min（最佳孵育時間需優化）。染色結束后，離心收集細胞，利用37℃預熱的新鮮培養液或緩沖液重懸細胞，被染色的細胞可用流式細胞儀、熒光酶標儀、熒光顯微鏡進行分析。

如果需要蓋玻片上固定化的細胞，那么可在鋪片前先用多聚賴氨酸（poly-D-lysine）包被載玻片或蓋玻片。

或者進行后續的固定和透化步驟，見步驟4。

4. 固定和透化

1）染色結束后，利用培養液或緩沖液清洗細胞；

2）小心吸走清洗液。換用新鮮配制且預熱的含2-4%甲醛的緩沖液或培養液進行細胞固定。

3）清洗細胞：吸除固定液，用適當緩沖液沖洗細胞數次。

4）細胞透化（可選）：

像ICC等實驗需要細胞要做透化，則可將已固定的細胞直接加入含有去污劑如Triton X-100的緩沖液中孵育。透化結束后，用緩沖液清洗細胞即可進行后續ICC實驗。經檢測，利用含0.2% Triton X-100的PBS孵育內皮細胞10 min可以達到良好的透化效果。

另外，還可利用預冷的丙酮透化5 min，之后用PBS清洗細胞。經驗證，即使后繼沒有進一步的抗體標記，丙酮透化處理也可降低背景信號。